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Toxin代北京試劑
產品時間:2024-02-20
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1.2 方法

1.2.1 黃連水提液的制備

稱取干燥黃連 10 g,超微粉碎,加入 200 mL 的超純水,浸泡 2 h,大火煎

至煮沸后文火,保持 30 min,紗布過濾;藥渣加溫水 300 mL,再大火煎至煮沸

后文火煎 30 min,過濾,合并濾液,45℃旋轉蒸發儀濃縮至 500 mL10000 rpm

離心 15 min,離心取上清,定容至 100 mL,濃縮濃度為 100 mg·mL-1,用 0.22 μm

的除菌器過濾除菌,分裝 4℃冰箱保存。

1.2.2 高效液相色譜檢測黃連品質

1)色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18150 mm×4·6 mm,5 μm);以乙腈—0.05 mol·L-1

磷酸二氫鉀溶液(50:50)(每 100 mL 中加十二垸基硫酸鈉 0.4 g,再以磷酸調節

pH 值為 4.0)為流動相;檢測波長為 345 nm;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。

2)標準曲線

分別稱表小檗堿 0.0018 g,黃連堿 0.0037 g,巴馬汀 0.0024 g,鹽酸小堿

0.002 g,置于 100 mL 容量瓶中,用流動相定容,得表小檗堿濃度為 18 μg·mL-1,

黃連堿濃度為 37 μg·mL-1,巴馬汀濃度為 24 μg·mL-1,鹽酸小堿濃度為 20

μg·mL-1 的混合標準品母液。再分別稀釋得到 7 個梯度的系列對照品溶液,進高

效液相色譜儀測定,最后以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標做四種物質的標準曲

線。

3)供試品溶液制備

水煮法制得黃連生藥濃度為 0.1 g·mL-1 的黃連溶液,再將該溶液在 12000 rpm

轉速下離心 20 min 除去不溶性雜質,之后取上清液 1 mL 10 mL 容量瓶用流動

相定容,再次用 12000 rpm 離心 15 min 除去不溶于流動相的雜質,最后用 0.22 μm

有機系濾膜過濾既得供試品溶液。

1.2.3 細菌培養

1)細菌培養 將菌株置于 TSB 液體培養液中,37℃,130 rpm 恒溫培養振

蕩器中培養,待細菌長至對數生長期時進行試驗。

2)細菌傳代 將長至對數期的細菌,2000 rpm 離心 3 min,棄上清,用 PBS

洗一次,離心,加入適量新鮮細菌培養液,重懸以適當比例傳代接種到 50 mL

新鮮培養基中,恒溫培養振蕩器中繼續培養。

3)細菌凍存 將對數生長期的細菌,2000 rpm 離心 3 min,棄上清,用

PBS 洗一次,離心,新鮮的培養液懸浮,加等體積已備好的甘油水溶液,分裝于

1.5 mL 離心管中,標明細菌株種類和凍存日期,置于-20℃冰箱中保存。

4)細菌復蘇 從-20℃里取出凍存菌種,待其解凍,用接種環挑一環至已15

備好的固體培養基中,四區劃線后放于 37℃5% CO2 培養箱內培養,待其長出

單菌落,用接種環挑取一個單菌落至新鮮培養基中進行活化。

1.2.4 MIC 的檢測

1)菌液的準備 將凍存的痢疾桿菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基進行復

蘇,待其有單菌落長出,接種于已備好的新鮮、無菌胰蛋白胨大豆肉湯(TSB

培養基中進行活化,待其培養至對數期,用 TSB 液體培養基將痢疾桿菌濃度調

節至 105-106 cfu·mL-1

2)樣品準備 配適當體積的固體培養基高壓滅菌后加入一定體積的黃連水

提液,然后半倍稀釋,使其含藥培養基的濃度為 0、1.252.5510、20 mg·mL-1,

倒入以備好的無菌平板中,每個平板中 5 mL 為宜,待其冷卻凝固之后,分別接

上以備好的菌懸液 50 μL 用涂菌器涂抹均勻,在 37℃的培養箱下進行培養。

3)樣品檢測 細菌檢測 24 h 后,觀察平板上菌種的生長情況,以培養基

上無菌生長的低濃度為黃連水提液的最小抑菌濃度。

1.2.5 痢疾桿菌生長曲線

1)藥物處理 將培養至對數期的痢疾桿菌接種到新鮮培養基中,使培養液

中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-15 mg·mL-1,10 mg·mL-1,無菌水為空白

對照組,37℃,130 rpm 搖床培養;

2)準備樣品 每隔 1 h 取各組樣品 2 mL,連續取 24 h

3)檢測樣品 用分光光度計測定在波長為 600 的各組吸光度 OD 值,取 3

次重復實驗的平均值。繪制黃連水提液作用后痢疾桿菌的生長曲線(OD 值為縱

坐標,時間為橫坐標)。

1.2.6 培養液中 DNA、RNA 等大分子物質的測定

1)藥物處理 將培養至對數期的痢疾桿菌接種到新鮮培養基中,使培養液

中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1,5mg·mL-1,10mg·mL-1,無菌水為空白對

照組,37℃,130 rpm 搖床培養;

2)樣品準備 連續 12 h 取各組樣品 2 mL,離心 10 min4000 rpm,棄沉

淀留上清。

3)檢測樣品 用紫外分光光度計測定上清液中 DNARNA 等大分子物質

的吸光度值,波長 260 nm。以無菌水為對照組,取 3 次重復實驗的平均值。

1.2.7 黃連對痢疾桿菌細胞壁的影響

將培養至對數期的痢疾桿菌加入到含 2.5 mg·mL-1,5 mg·mL-1,10 mg·mL-1

黃連的 TSB 液體培養基中,使培養基含菌體 107 cfu·mL-1,于 37℃、130 rpm

床培養,以無菌作為對照組,分別在 0、2、4、6、8、10 12 h 定時取樣 5000 rpm16

10 min 離心取上清,上清液按照表 1 加入 96 孔板中。

用酶標儀測定 96 孔板中各樣品在 520 nm 時的吸光度,并隨時間延長檢測各

時間點的吸光度變化情況,平行測定 3 次取平均值。按照公式計算 AKP 的含量

(堿性磷酸酶(金氏單位/100 mL=[(測定孔-空白孔)/(標準空-空白孔)

酚標準品濃度(0.02 mg·mL-1×100 mL

1.2.8 黃連對痢疾桿菌呼吸代謝系統的影響

1)黃連處理 將培養至對數期的痢疾桿菌接種到新鮮培養基中,使培養液

中黃連的終濃度為 2.5 mg·mL-1,5 mg·mL-1,10 mg·mL-1,無菌水為空白對照組,

37℃,130 rpm 搖床培養 10 h,每組設置三個平行;

2)準備樣品 將培養的菌液 5000 rpm 離心 10 min,棄去上清液,

3)處理樣品 用 0.1 mol·L Tris-HClpH7.4)緩沖液洗菌沉淀 2-3 次后,

加入等體積的溶菌溶液,37℃水浴 20 min 后,立即冰浴,再加入 Tris-SDS

pH=9.0)緩沖液 1 mL,10000 rpm 低溫離心 15 min,取出上清液;

4)檢測樣品 酶活性的測定按試劑盒說明書操作。蛋白定量方法參照

Bradford

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